Введение

Убиквитин - небольшой белок примерно 76 аминокислот, найденный во всех эукариотических камерах и очень хорошо сохранившийся среди видов. Посредством посттрансляционной модификации различных белков убиквитин участвует во многих различных биологических процессах, включая деградацию белка, торговлю белком, репарацию ДНК, регуляцию генов и т.д. Из-за его повсеместного присутствия в камерах и участия во многих фундаментальных процессах убиквитин был в особом внимании обширных исследований на последовательном, структурном и функциональном уровне.

Можно просмотреть трехмерную структуру убиквитина, загрузив файл кристаллической структуры из базы данных PDB и затем отобразив его с помощью molviewer функция. По умолчанию структура белка визуализирована таким образом, что каждый атом представлен мячом, а каждая связь представлена карандашом. Изменить режим тонирования можно путем выбора параметров отображения под рисунком. Можно также повернуть и манипулировать структурой, щелкнув мышью, перетащив белок или введя команды Rasmol в консоли сценариев.

В этом примере мы исследуем структурные характеристики убиквитина через комбинации команд Расмола, переданных в evalrasmolscript функция. Однако можно выполнить тот же анализ с помощью окна Molecule Viewer. Информация для белка убиквитина представлена в MAT-файле ubilikedata.mat.

load('ubilikedata.mat','ubi')

Также можно использовать getpdb функция для извлечения информации о белке из репозитория PDB и загрузки ее в MATLAB ®. Обратите внимание, что данные в общедоступных хранилищах часто кураторятся и обновляются; поэтому результаты этого примера могут несколько отличаться при использовании современных наборов данных.

ubi = getpdb('1ubi');

h1 = molviewer(ubi);

evalrasmolscript(h1, 'select all; wireframe 100; background black;');

Визуализация молекулы

Мы можем посмотреть на ubiquitin складку с помощью «мультфильма» рендеринга, который четко отображает элементы вторичной структуры. Мы ограничиваем наш выбор белком, так как мы не заинтересованы в отображении других гетерогенных частиц, таких как молекулы воды.

% Display the molecule as cartoon and color the atoms according to their
% secondary structure assignment. Then remove other atoms and bonds.
evalrasmolscript(h1, ['spacefill off; wireframe off; ' ...
                      'restrict protein; cartoon on; color structure; ' ...
                      'center selected;']);

Исследование молекулы путем прядения и масштабирования

Убиквитиновая складка состоит из пяти антипараллельных бета-прядей, одной альфа-спирали, небольшой 3-10 спирали, и нескольких поворотов и циклов. Складка напоминает небольшой ствол, причем бета-лист образует одну сторону, а альфа-спираль образует другую сторону ствола. Нижняя часть закрыта 3-10 спиралью. Мы можем лучше оценить компактную, шаровую складку убиквитина, вращая структуру на 360 степени и увеличивая и уменьшая с помощью команды «двигаться».

% Animate the display by making the structure spin and zoom in
evalrasmolscript(h1, ['move 0 180 0 40 0 0 0 0 5; ' ... %
                      ... %  rotate y by 180, zoom in by 40, time = 5 sec
                      'move 0 180 0 -40 0 0 0 0 5;']); 
                          %  rotate y by 180, zoom out by 40, time = 5 sec

Оценка распределения аминокислотного заряда в структуре

Компактность и высокая стабильность убиквитиновой складки связаны с пространственным распределением гидрофобных и гидрофильных аминокислот в сложенном состоянии. Мы можем рассмотреть распределение заряженных аминокислот путем выбора положительно и отрицательно заряженных остатков, а затем путем преобразования этих атомов с различными цветами (красный и синий соответственно). Мы также можем сделать молекулы воды белыми, чтобы увидеть их связь с заряженными остатками.

evalrasmolscript(h1, ['select protein; color gray; ' ... 
                      'select positive; color red; spacefill 300; ' ...
                      'select negative; color blue; spacefill 300; ' ...
                      'select HOH; color white; spacefill 100;']); % water atoms

Заряженные аминокислоты расположены в основном на поверхности, подвергающейся воздействию растворителя, где они взаимодействуют с молекулами воды. В частности, мы замечаем, что распределение заряда неоднородно по бокам ствола убиквитина. Фактически, сторона с альфа-спиралью, по-видимому, более переполнена заряженными аминокислотами, чем сторона, содержащая бета-цепи.

Исследование профиля гидрофобности структуры

Мы можем выполнить аналогичный анализ, рассмотрев пространственное распределение некоторых гидрофобных аминокислот, таких как аланин, изолейцин, валин, лейцин и метионин. Можно также использовать «гидрофобную» метку Расмола для выбора всех гидрофобных остатков.

% color hydrophobic amino acids green
evalrasmolscript(h1, ['select all; spacefill off; color gray; ' ...
                      'select Ala or Ile or Val or Leu or Met; ' ...
                      'color green; wireframe 100;' ...
                      'move 90 0 0 0 0 0 0 0 1; move 0 -45 0 0 0 0 0 0 1']);

В отличие от указанных выше заряженных аминокислот, гидрофобные аминокислоты расположены в основном внутри цилиндра. Это дает высокую стабильность убиквитиновой складке, поскольку гидрофобные аминокислоты экранируются от растворителя, что делает белковую структуру компактной и плотной.

Измерение атомных расстояний

Убиквитин отображает плотную складку с одной альфа-спиралью, идущей через одну сторону малого ствола. Длина этой альфа-спирали представляет некоторые изменения среди представителей семейства убиквитиноподобных белков. Мы можем определить фактический размер спирали или путем двойного нажатия по соответствующим атомам или путем использования команд MATLAB ® и Rasmol следующим образом.

% reset the display to cartoons
evalrasmolscript(h1, ['reset; select all; spacefill off; wireframe off; '...
                     'cartoon on; color structure;']);

% determine the boundaries of the alpha helix
initHelixRes = ubi.Helix(1).initSeqNum % alpha helix starting residue

initHelixRes = 23

endHelixRes = ubi.Helix(1).endSeqNum % alpha helix ending residue

endHelixRes = 34

% highlight the starting and ending residues of helix
evalrasmolscript(h1, ['select ' num2str(initHelixRes) ' or ' ...
    num2str(endHelixRes) '; color red; wireframe 100;']);

% determine atom numbers for starting and ending residues
initHelixAtoms = ubi.Model.Atom([ubi.Model.Atom(:).resSeq]==initHelixRes);
endHelixAtoms = ubi.Model.Atom([ubi.Model.Atom(:).resSeq]==endHelixRes);
initHelix = min([initHelixAtoms.AtomSerNo]); % Helix starting atom
endHelix = min([endHelixAtoms.AtomSerNo]); % Helix ending atom
evalrasmolscript(h1, ['measure ' num2str(initHelix) ' ' num2str(endHelix) ';']);

Отображение и маркировка остатков лизина в структуре убиквитина

Процесс убиквитинирования - присоединение молекулы убиквитина к белку-мишени - опосредуется образованием изопептидной связи между С-концевым 4-остаточным хвостом убиквитина и лизином целевого белка. Если целевой белок является другим убиквитином, процесс называется полиубиквитинацией. Полиубиквитиновые цепи, состоящие по меньшей мере из четырех убиквитинов, используются для маркировки белков-мишеней для деградации протеасомой. Все семь лизинов в убиквитине можно использовать в процессе полиубиквитинирования, получая различные цепи, которые изменяют белок-мишень по-разному. Мы можем посмотреть на пространственное распределение лизинов в убиквитиновой складке путем выбора и маркировки альфа-углеродов каждого лизина в структуре.

% highlight the Lysine residues in the structure and the C-terminal tail
% involved in the isopeptide bond formation
evalrasmolscript(h1, ['restrict protein; cartoon off; wireframe off; measure off; ' ...
                      ... % undo previous selection
                      'backbone 100; color structure; select Lys; wireframe 100; ' ...
                      ... % select Lysines
                      'select Lys and *.ca; spacefill 300; labels on; ' ...
                      ... % label alpha carbons
                      'select 72-76; wireframe 100; color cyan; ']);
                          % select C-terminal tail

Несколько исследований показали, что различные роли играют полиубиквитины, когда молекулы соединяются вместе через различные лизины. Для примера полиубиквитины Lys (11) -, Lys (29) - и Lys (48) - связывают белки-мишенью для протеасомы (то есть для деградации). Напротив, Lys (6) - и Lys (63) - связанные полиубиквитины связаны с обратимыми модификациями, такими как контроль за оборотом белка.

Исследование изопептидной связи при диубиквитине

Кристаллическая структура диубиквитиновой цепи, состоящей из двух фрагментов, представлена в записи PDB 1aar. Мы можем просмотреть и пометить фактическую изопептидную связь между C-концевым хвостом одного убиквитина (маркированного как цепь A) и Lys (48) другого убиквитина (маркированного как цепь B).

Извлеките белок 1aar из PDB или загрузите данные из MAT-файла.

aar = getpdb('1aar');

load('ubilikedata.mat','aar')

h2 = molviewer(aar);

evalrasmolscript(h2, ['restrict protein; color chain;  ' ...
                      'spacefill off; wireframe off; ' ... 
                      'cartoon on; select 76:A, 48:B; spacefill;  ' ...
                      ... % isopeptide bond
                      'select 76:A and *.ca; ' ... % select alpha carbon
                      'set labeloffset 40 10; label isopeptide bond; ' ...
                      'move 0 360 0 -20 0 0 0 0 5; ']); % animate

Выравнивание последовательностей Убиквитина и СУМО

Существует удивительно разнообразное семейство убиквитиноподобных белков, которые демонстрируют значительное структурное сходство с убиквитином. Одним из этих белков является SUMO (Small Ubiquitin-подобный MOdifier), небольшой белок, участвующий в широком спектре посттрансляционных модификаций, таких как транскрипционная регуляция, ядерно-цитозольный транспорт и стабильность белка. Подобно убиквитинации, ковалентное присоединение и отслоение SUMO происходит через каскад ферментативных действий. Несмотря на структурное и оперативное сходство между убиквитином и SUMO, эти два белка демонстрируют довольно ограниченное сходство последовательностей, что видно из их глобального выравнивания последовательностей.

Извлеките белок SUMO из PDB или загрузите данные из MAT-файла.

aar = getpdb('lwm2');

load('ubilikedata.mat','sumo')

Выровнять две первичные последовательности из обоих соединений.

[score aln] = nwalign(ubi.Sequence.Sequence, sumo.Sequence.Sequence)

score = -3.3333

aln = 3x82 char array
    'MQ----I-F-VKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG'
    ' :    | : |    |::: ::::    : ::     :::|:   | |: | |: :::  | :: ::: |:|:  |:: :  '
    'TENNDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRFRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTID-VFQ-Q--'

Наложение структур Убиквитина и СУМО

В порядок, чтобы лучше оценить структурное сходство убиквитина и SUMO, выполните трехмерное наложение двух структур. Использование pdbsuperpose функция, мы вычисляем и применяем линейное преобразование (перемещение, отражение, ортогональное вращение и масштабирование) таким образом, чтобы атомы одной структуры наилучшим образом соответствовали атомам другой структуры.

close (h1, h2); % close previous instances of molviewer

pdbsuperpose(ubi, sumo);

h3 = findobj('Tag', 'BioinfoMolviewer'); % retrieve handle for molviewer
evalrasmolscript(h3, ['select all; zoom 200; center selected']);

evalrasmolscript(h3, ['select all; cartoons off; ' ...
                      'select model = 1; strands on; color red; ' ...% ubiquitin
                      'select model = 2; strands on; color blue;']); % SUMO

Выбрав соответствующую кнопку опции в разделе Models окна Molecule Viewer, мы можем просмотреть структуру убиквитина (Model = 1) и структуру SUMO-2 (Model = 2) отдельно или мы можем посмотреть на них с наложением (Model = All). Когда обе модели активно отображаются, структурное сходство между двумя складками поражает.

Сохранение структурной складки в отсутствие значительного сходства последовательностей может указывать на вхождение конвергентной эволюции для этих двух белков. Однако некоторые механизмы убиквитинирования и сумоилирования имеют аналогии, которые не связаны друг с другом и могут предполагать некоторые более глубокие, возможно, отдаленные, отношения. Что более важно, тот факт, что спектр функций, выполняемых убиквитином и SUMO-2, так широко распространен, говорит о том, что высокая стабильность и компактность убиквитиноподобной сверхкратности может быть причиной ее сохранения.

close all;