Создайте объект CufflinksOptions задать опции запонок, такие как количество параллельных потоков и выходной директории, чтобы сохранить результаты.

cflOpt = CufflinksOptions;
cflOpt.NumThreads = 8;
cflOpt.OutputDirectory = "./cufflinksOut";

Файлы SAM предусмотрели этот пример, содержат выровненные чтения для Микоплазмы pneumoniae от двух выборок с три, реплицирует каждого. Чтения моделируются 100bp-чтения для двух генов (gyrA и gyrB) расположенный друг рядом с другом на геноме. Все чтения сортируются по ссылочному положению, как требуется по cufflinks.

sams = ["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam",...
        "Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"];

Соберите транскриптом от выровненных чтений.

[gtfs,isofpkm,genes,skipped] = cufflinks(sams,cflOpt);

gtfs является списком файлов GTF, которые содержат собранные изоформы.

Сравните собранные изоформы с помощью cuffcompare.

stats = cuffcompare(gtfs);

Объедините собранные расшифровки стенограммы с помощью cuffmerge.

mergedGTF = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput');

mergedGTF сообщает о только одной расшифровке стенограммы. Это вызвано тем, что два гена интереса расположены друг рядом с другом, и cuffmerge не может отличить два отличных гена. Чтобы вести cuffmerge, используйте ссылочный GTF (gyrAB.gtf), содержащий информацию об этих двух генах. Если файл не расположен в той же директории, от которой вы запускаете cuffmerge, необходимо также задать путь к файлу.

gyrAB = which('gyrAB.gtf');
mergedGTF2 = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput2',...
			'ReferenceGTF',gyrAB);

Вычислите распространенности (уровни экспрессии) от выровненных чтений для каждой выборки.

abundances1 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput1');
abundances2 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput2');

Оцените значение изменений в выражении для генов и расшифровок стенограммы между условиями путем выполнения тестирования дифференциала с помощью cuffdiff. Функция cuffdiff действует на двух отличных шагах: функция сначала оценивает распространенности от выровненных чтений, и затем выполняет статистический анализ. В некоторых случаях (например, распределяя вычисляющий загрузку через несколько рабочих), выполнение двух шагов отдельно желательно. После выполнения первого шага с cuffquant можно затем использовать бинарный выходной файл CXB в качестве входа к cuffdiff, чтобы выполнить статистический анализ. Поскольку cuffdiff возвращает несколько файлов, укажите, что выходная директория рекомендуется.

isoformDiff = cuffdiff(mergedGTF2,[abundances1,abundances2],...
                      'OutputDirectory','./cuffdiffOutput');

Отобразите таблицу, содержащую дифференциальные результаты испытаний выражения для этих двух генов gyrB и gyrA.

readtable(isoformDiff,'FileType','text')

ans =

  2×14 table

        test_id            gene_id        gene              locus             sample_1    sample_2    status     value_1       value_2      log2_fold_change_    test_stat    p_value    q_value    significant
    ________________    _____________    ______    _______________________    ________    ________    ______    __________    __________    _________________    _________    _______    _______    ___________

    'TCONS_00000001'    'XLOC_000001'    'gyrB'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     1.0913e+05    4.2228e+05          1.9522           7.8886      5e-05      5e-05        'yes'   
    'TCONS_00000002'    'XLOC_000001'    'gyrA'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     3.5158e+05    1.1546e+05         -1.6064          -7.3811      5e-05      5e-05        'yes'   

Можно использовать cuffnorm, чтобы сгенерировать нормированные таблицы выражения для последующих анализов. результаты cuffnorm полезны, когда у вас есть много выборок, и вы хотите кластеризировать их или уровни экспрессии графика для генов, которые важны в вашем исследовании. Обратите внимание на то, что вы не можете выполнить дифференциальный анализ выражения с помощью cuffnorm.

Задайте массив ячеек, где каждый элемент является вектором строки, содержащим имена файлов для одной выборки с, реплицирует.

alignmentFiles = {["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                  ["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"]}
isoformNorm = cuffnorm(mergedGTF2, alignmentFiles,...
                      'OutputDirectory', './cuffnormOutput');

Отобразите таблицу, содержащую нормированные уровни экспрессии для каждой расшифровки стенограммы.

readtable(isoformNorm,'FileType','text')

ans =

  2×7 table

      tracking_id          q1_0          q1_2          q1_1          q2_1          q2_0          q2_2   
    ________________    __________    __________    __________    __________    __________    __________

    'TCONS_00000001'    1.0913e+05         78628    1.2132e+05    4.3639e+05    4.2228e+05    4.2814e+05
    'TCONS_00000002'    3.5158e+05    3.7458e+05    3.4238e+05    1.0483e+05    1.1546e+05    1.1105e+05

Имена столбцов начиная с q имеют формат: conditionX_N, указывая, что столбец содержит значения для, реплицируют N conditionX.