Exponenta Banner
exponenta event banner

cuffdiff

Определение существенных изменений в выражении транскрипта

свернуть все на странице

Синтаксис

манжета (transcriptsAnnot, alignityFiles)
манжета (transcriptsAnnot, alignityFiles, opt)
манжета (transcriptsAnnot, alignureFiles, Name, Value)
[isoformsDiff, geneDiff, tssDiff, cdsExp, splingDiff, cdsDiff, promotersDiff] = манжета (___)

Описание

пример

cuffdiff(transcriptsAnnot,alignmentFiles) идентифицирует значительные изменения в экспрессии транскрипта между образцами в alignmentFiles использование файла аннотации стенограммы transcriptsAnnot [1].

cuffdiff требуется пакет поддержки «Запонки» для Toolbox™ биоинформатики. Если пакет поддержки не установлен, функция предоставляет ссылку для загрузки. Дополнительные сведения см. в разделе Пакеты поддержки ПО для панели инструментов биоинформатики.

Примечание

cuffdiff поддерживается только на платформах Mac и UNIX ®.

cuffdiff(transcriptsAnnot,alignmentFiles,opt) использует дополнительные параметры, указанные opt.

cuffdiff(transcriptsAnnot,alignmentFiles,Name,Value) использует дополнительные параметры, заданные одним или несколькими аргументами пары имя-значение. Например, cuffdiff('gyrAB.gtf',["Myco_1_1.sam", "Myco_2_1.sam"],'NumThreads',5) задает пять параллельных потоков.

[isoformsDiff,geneDiff,tssDiff,cdsExp,splicingDiff,cdsDiff,promotersDiff] = cuffdiff(___) возвращает имена файлов, содержащих результаты теста дифференциального выражения, используя любую из комбинаций входных аргументов в предыдущих синтаксисах. По умолчанию функция сохраняет все файлы в текущей папке.

Примеры

свернуть все

Создать CufflinksOptions объект для определения параметров cfflinks, таких как количество параллельных потоков и папка вывода для хранения результатов.

cflOpt = CufflinksOptions;
cflOpt.NumThreads = 8;
cflOpt.OutputDirectory = "./cufflinksOut";

Файлы SAM, представленные в этом примере, содержат выровненные чтения для Mycoplasma pneumoniae из двух образцов с тремя репликациями каждый. Считывание моделируется 100 bp для двух генов (gyrA и gyrB) расположены рядом друг с другом на геноме. Все операции чтения сортируются по ссылочному положению, как требуется cufflinks.

sams = ["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam",...
        "Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"];

Соберите транскриптом из выровненных считываний.

[gtfs,isofpkm,genes,skipped] = cufflinks(sams,cflOpt);

gtfs - список GTF-файлов, содержащих собранные изоформы.

Сравнение собранных изоформ с помощью cuffcompare.

stats = cuffcompare(gtfs);

Объединить собранные стенограммы с помощью cuffmerge.

mergedGTF = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput');

mergedGTF сообщает только одну стенограмму. Это потому, что два интересующих гена расположены рядом друг с другом, и cuffmerge не может различить два различных гена. Вести cuffmerge, использовать эталонный GTF (gyrAB.gtf), содержащий информацию об этих двух генах. Если файл находится не в том же каталоге, в котором выполняется cuffmerge из, необходимо также указать путь к файлу.

gyrAB = which('gyrAB.gtf');
mergedGTF2 = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput2',...
			'ReferenceGTF',gyrAB);

Рассчитайте плотность (уровни выражений) на основе выровненных чтений для каждого образца.

abundances1 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput1');
abundances2 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput2');

Оцените значимость изменений в экспрессии генов и транскриптов между состояниями, выполнив дифференциальное тестирование с использованием cuffdiff. cuffdiff функция работает в два отдельных шага: функция сначала оценивает изобилие из выровненных считываний, а затем выполняет статистический анализ. В некоторых случаях (например, распределение вычислительной нагрузки между несколькими работниками) выполнение этих двух шагов по отдельности является желательным. После выполнения первого шага с cuffquant, затем можно использовать двоичный выходной файл CXB в качестве входных данных для cuffdiff для выполнения статистического анализа. Поскольку cuffdiff возвращает несколько файлов, укажите рекомендуемый выходной каталог.

isoformDiff = cuffdiff(mergedGTF2,[abundances1,abundances2],...
                      'OutputDirectory','./cuffdiffOutput');

Отображение таблицы, содержащей результаты теста дифференциальной экспрессии для двух генов gyrB и gyrA.

readtable(isoformDiff,'FileType','text')
ans =

  2×14 table

        test_id            gene_id        gene              locus             sample_1    sample_2    status     value_1       value_2      log2_fold_change_    test_stat    p_value    q_value    significant
    ________________    _____________    ______    _______________________    ________    ________    ______    __________    __________    _________________    _________    _______    _______    ___________

    'TCONS_00000001'    'XLOC_000001'    'gyrB'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     1.0913e+05    4.2228e+05          1.9522           7.8886      5e-05      5e-05        'yes'   
    'TCONS_00000002'    'XLOC_000001'    'gyrA'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     3.5158e+05    1.1546e+05         -1.6064          -7.3811      5e-05      5e-05        'yes'

Вы можете использовать cuffnorm для создания нормализованных таблиц выражений для дальнейшего анализа. cuffnorm результаты полезны, когда у вас есть много образцов, и вы хотите сгруппировать их или построить график уровней экспрессии для генов, которые важны в вашем исследовании. Обратите внимание, что невозможно выполнить дифференциальный анализ выражений с помощью cuffnorm.

Укажите массив ячеек, где каждый элемент является строковым вектором, содержащим имена файлов для одного образца с репликациями.

alignmentFiles = {["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                  ["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"]}
isoformNorm = cuffnorm(mergedGTF2, alignmentFiles,...
                      'OutputDirectory', './cuffnormOutput');

Отображение таблицы, содержащей нормализованные уровни выражений для каждого транскрипта.

readtable(isoformNorm,'FileType','text')
ans =

  2×7 table

      tracking_id          q1_0          q1_2          q1_1          q2_1          q2_0          q2_2   
    ________________    __________    __________    __________    __________    __________    __________

    'TCONS_00000001'    1.0913e+05         78628    1.2132e+05    4.3639e+05    4.2228e+05    4.2814e+05
    'TCONS_00000002'    3.5158e+05    3.7458e+05    3.4238e+05    1.0483e+05    1.1546e+05    1.1105e+05

Имена столбцов, начинающиеся с q, имеют формат conditionX_N, указывающий, что столбец содержит значения для репликации N условия X.

Входные аргументы

свернуть все

Имя файла аннотации текста, указанного как строковый или символьный вектор. Файл может быть файлом GTF или GFF, созданным cufflinks, cuffcompareили другой источник аннотаций GTF.

Пример: "gyrAB.gtf"

Типы данных: char | string

Имена файлов SAM, BAM или CXB, содержащих записи выравнивания для каждого образца, указанного как строковый вектор или массив ячеек. При использовании массива ячеек каждый элемент должен быть строковым вектором или массивом символьных векторов, задающих файлы выравнивания для каждой копии одного образца.

Пример: ["Myco_1_1.sam", "Myco_2_1.sam"]

Типы данных: char | string | cell

cuffdiff опции, указанные как CuffDiffOptions объект, строка или символьный вектор. Вектор строки или символа должен быть в оригинале cuffdiff синтаксис параметра (префикс одного или двух тире) [1].

Аргументы пары «имя-значение»

Укажите дополнительные пары, разделенные запятыми Name,Value аргументы. Name является именем аргумента и Value - соответствующее значение. Name должен отображаться внутри кавычек. Можно указать несколько аргументов пары имен и значений в любом порядке как Name1,Value1,...,NameN,ValueN.

Пример: cuffdiff('gyrAB.gtf',["Myco_1_1.sam", "Myco_2_1.sam"],'NumThreads',5,'DispersionMethod',"per-condition")

Образцы меток, указанные как строка, строковый вектор, символьный вектор или массив ячеек символьных векторов. Количество меток должно равняться количеству образцов, или значение должно быть пустым [].

Пример: 'ConditionLabels',["Control","Mutant1","Mutant2"]

Типы данных: string | char | cell

Имя файла контрастности, указанное как строковый или символьный вектор. Файл должен быть текстовым файлом с разделителями табуляции из двух столбцов, где каждая строка указывает два условия для сравнения с помощью cuffdiff. Метки условий в файле должны соответствовать меткам, указанным для ConditionLabels или имена образцов. Файл должен иметь одну строку заголовка в качестве первой строки, за которой должна следовать одна строка для каждого контраста. Ниже приведен пример формата файла контрастности.

condition_Acondition_B

Контроль

Mutant1

Контроль

Mutant2

Если вы не предоставите этот файл, cuffdiff сравнивает каждую пару условий ввода, которые могут повлиять на производительность.

Пример: 'ContrastFile',"contrast.txt"

Типы данных: char | string

Метод моделирования дисперсии в счетчиках фрагментов по репликам, указанный как один из следующих параметров:

  • "pooled" - Функция использует каждое реплицированное условие для построения модели и усредняет эти модели в глобальную модель для всех условий в эксперименте.

  • "per-condition" - функция создает модель для каждого условия. Этот параметр можно использовать только в том случае, если все условия имеют репликацию.

  • "blind" - Функция рассматривает все образцы как копии одного глобального распределения и создает одну модель.

  • "poisson" - Дисперсия в подсчетах фрагментов является моделью отравления, где количество фрагментов прогнозируется как среднее по репликам. Этот метод не рекомендуется.

Выберите метод в зависимости от того, должна ли изменчивость в каждой группе образцов быть одинаковой.

  • При сравнении двух групп, где первая группа имеет низкую вариабельность перекрестной репликации, а вторая группа имеет высокую изменчивость, выберите per-condition способ.

  • Если условия имеют аналогичные уровни изменчивости, выберите pooled способ.

  • Если в каждом условии имеется только одна репликация, выберите blind способ.

Пример: 'DispersionMethod',"blind"

Типы данных: char | string

Флаг для выполнения тестов переключения изоформ, указанный как true или false. Эти тесты оценивают, сколько дифференциального сплайсинга существует в изоформах из одного первичного транскрипта. По умолчанию используется значение true и результаты теста сохраняются в выходном файле. splicing.diff.

Пример: 'DoIsoformSwitch',false

Типы данных: logical

Флаг для нормализации количества фрагментов к фрагментам на килобазу на миллион отображенных операций чтения (FPKM), указанный как true или false.

Пример: 'EffectiveLengthCorrection',false

Типы данных: logical

Команды должны иметь собственный синтаксис (префикс одного или двух тире). Эта опция используется для применения флагов и флагов без документов без соответствующих свойств MATLAB ®.

Пример: 'ExtraCommand','--library-type fr-secondstrand'

Типы данных: char | string

Частота ложного обнаружения для использования во время статистических тестов, заданная как скаляр между 0 и 1.

Пример: 'FalseDiscoveryRate',0.01

Типы данных: double

Имя файла FASTA со ссылочными транскриптами для обнаружения смещения в подсчетах фрагментов, указанных как строковый или символьный вектор. Библиотечный препарат может вводить последовательность-специфическое смещение в эксперименты РНК-Seq. Предоставление эталонных транскриптов повышает точность оценок численности транскриптов.

Пример: 'FragmentBiasCorrection',"bias.fasta"

Типы данных: char | string

Ожидаемая средняя длина фрагмента, заданная как положительное целое число. Значение по умолчанию: 200 базовые пары. Функция может узнать среднее значение длины фрагмента для каждого файла SAM. Использование этого параметра не рекомендуется для парных операций чтения.

Пример: 'FragmentLengthMean',100

Типы данных: double

Ожидаемое стандартное отклонение для распределения длины фрагмента, указанное как положительный скаляр. Значение по умолчанию: 80 базовые пары. Функция может узнать стандартное отклонение длины фрагмента для каждого файла SAM. Использование этого параметра не рекомендуется для парных операций чтения.

Пример: 'FragmentLengthSD',70

Типы данных: double

Флажок для создания файлов дифференциального анализа (*.diff), указано как true или false.

Пример: 'GenerateAnalysisDiff',false

Типы данных: logical

Флажок для включения всех свойств объекта с соответствующими значениями по умолчанию при преобразовании в исходный синтаксис опций, указанный как true или false. Свойства можно преобразовать в исходный синтаксис с помощью одного или двух тире (например, '-d 100 -e 80') с помощью getCommand. Значение по умолчанию false означает, что при звонке getCommand(optionsObject), он преобразует только указанные свойства. Если значение равно true, getCommand преобразует все доступные свойства с значениями по умолчанию для неопределенных свойств в исходный синтаксис.

Примечание

Если установить IncludeAll кому true, программа преобразует все доступные свойства со значениями по умолчанию для неопределенных свойств. Единственным исключением является то, что если значением по умолчанию свойства является NaN, Inf, [], '', или "", то программное обеспечение не переводит соответствующее свойство.

Пример: 'IncludeAll',true

Типы данных: logical

Минимальное количество реплик для тестирования генов на дифференциальную регуляцию, указанное как положительное целое число. Функция пропускает тесты, когда число репликаций меньше указанного значения.

Пример: 'IsoformShiftReplicates',2

Типы данных: double

Флаг для исправления по длине транскрипта, указанный как true или false. Задайте для этого значения значение false только когда количество фрагментов не зависит от размера признаков, например, для небольших библиотек РНК без фрагментации и для 3 '-концевого секвенирования, где все фрагменты имеют одинаковую длину.

Пример: 'LengthCorrection',false

Типы данных: logical

Метод нормализации размера библиотеки, указанный как один из следующих параметров.

  • "geometric" - Функция масштабирует значения FPKM на среднее среднее геометрическое количества фрагментов во всех библиотеках, как описано в [2].

  • "classic-fpkm" - Функция не применяет масштабирование к значениям FPKM или подсчетам фрагментов.

  • "quartile" - функция масштабирует значения FPKM по соотношению верхних квартилей между количеством фрагментов и средним значением по всем библиотекам.

Пример: 'LibraryNormalizationMethod',"classic-fpkm"

Типы данных: char | string

Имя файла GTF или GFF, содержащего транскрипты, игнорируемые при анализе, указанное как строковый или символьный вектор. Некоторые примеры транскриптов, которые следует игнорировать, включают аннотированные транскрипты рРНК, митохондриальные транскрипты и другие обильные транскрипты. Игнорирование этих транскриптов улучшает надежность оценок изобилия.

Пример: 'MaskFile',"excludes.gtf"

Типы данных: char | string

Максимальное количество фрагментов, включаемых для каждого локуса перед пропуском новых фрагментов, указанное как положительное целое число. Пропущенные фрагменты помечаются статусом HIDATA в файле skipped.gtf.

Пример: 'MaxBundleFrags',400000

Типы данных: double

Максимальное число выровненных операций чтения, включаемых для каждого фрагмента перед пропуском новых операций чтения, указанное как положительное целое число. Inf, значение по умолчанию, не устанавливает ограничения на максимальное количество выровненных чтений.

Пример: 'MaxFragAlignments',1000

Типы данных: double

Максимальное число итераций для оценки максимального правдоподобия изобилия, указанное как положительное целое число.

Пример: 'MaxMLEIterations',4000

Типы данных: double

Минимальное количество выравниваний, необходимое в локусе для выполнения проверки значимости различий между выборками, указанное как положительное целое число.

Пример: 'MinAlignmentCount',8

Типы данных: double

Минимальная плотность изоформы для включения в тесты дифференциального выражения, заданная как скаляр между 0 и 1. Для альтернативных изоформ, количественно определяемых ниже указанного значения, функция округляет изобилие до нуля. Указанное значение является долей основной изоформы. Функция выполняет эту фильтрацию после оценки MLE, но до оценки MAP, чтобы улучшить надежность генерации доверительного интервала и анализа дифференциальной экспрессии. Использование значения параметра, отличного от значения по умолчанию, не рекомендуется.

Пример: 'MinIsoformFraction',1e-5

Типы данных: double

Флаг для улучшения оценки плотности для считываний, сопоставленных с несколькими геномными позициями с использованием метода спасения, указанного как true или false. Если значение равно falseфункция делит множественные считывания равномерно на все отображенные позиции. Если значение равно trueфункция использует дополнительную информацию, включая оценку численности генов, предполагаемую длину фрагмента и смещение фрагмента, для улучшения оценки численности транскриптов.

Способ спасения описан в [3].

Пример: 'MultiReadCorrection',true

Типы данных: logical

Флаг для использования только фрагментов, совместимых со ссылочным транскриптом, для вычисления значений FPKM, указанных как true или false.

Пример: 'NormalizeCompatibleHits',false

Типы данных: logical

Флаг для включения всех фрагментов для вычисления значений FPKM, указанных как true или false. Если значение равно trueфункция включает все фрагменты, включая фрагменты без совместимой ссылки.

Пример: 'NormalizeTotalHits',true

Типы данных: logical

Число назначений фрагментов, выполняемых для каждого транскрипта, указанное как положительное целое число. Для каждого фрагмента, взятого из транскрипта, функция выполняет заданное количество назначений вероятностно, чтобы определить неопределенность назначения транскрипта и оценить матрицу дисперсии-ковариации для назначенных счетчиков фрагментов.

Пример: 'NumFragAssignmentSamples',40

Типы данных: double

Число вытягиваний из отрицательного биномиального генератора случайных чисел для каждого транскрипта, заданного как положительное целое число. Каждый розыгрыш представляет собой ряд фрагментов, которые функция вероятностно присваивает транскриптам в транскриптоме для определения неопределенности назначения и оценки матрицы дисперсии-ковариации для назначенных счетчиков фрагментов.

Пример: 'NumFragSamples',90

Типы данных: double

Число параллельных потоков для использования, указанное как положительное целое число. Потоки выполняются на отдельных процессорах или ядрах. Увеличение количества потоков, как правило, значительно улучшает время выполнения, но увеличивает объем памяти.

Пример: 'NumThreads',4

Типы данных: double

Каталог для хранения результатов анализа, указанный как строковый или символьный вектор.

Пример: 'OutputDirectory',"./AnalysisResults/"

Типы данных: char | string

Начальное число для генератора случайных чисел, указанное как неотрицательное целое число. Установка начального значения обеспечивает воспроизводимость результатов анализа.

Пример: 'Seed',10

Типы данных: double

Флаг для обработки входных образцов как временных рядов, а не как независимых экспериментальных условий, указанных как true или false. Если задано значение true, вы должны предоставить образцы в порядке увеличения времени: первый SAM файл должен быть для первого момента времени, второй SAM файл для второго момента времени и так далее.

Пример: 'TimeSeries',true

Типы данных: logical

Выходные аргументы

свернуть все

Имя файла, содержащего результаты дифференциального выражения на уровне транскрипта, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/isoform_exp.diff".

Имя файла, содержащего результаты дифференциальной экспрессии на уровне генов, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/gene_exp.diff".

Имя файла, содержащего результаты дифференциального выражения первичного транскрипта, возвращаемого в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/tss_group_exp.diff".

Имя файла, содержащего результаты дифференциального выражения кодирующей последовательности, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/cds_exp.diff".

Имя файла, содержащего результаты дифференциального сращивания изоформ, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/splicing.diff".

Имя файла, содержащего выходные данные последовательности дифференциального кодирования, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/cds.diff".

Имя файла, содержащего информацию об использовании дифференциального промотора, существующего между образцами, возвращаемое в виде строки.

Выходная строка также включает информацию каталога, определенную OutputDirectory. По умолчанию используется текущий каталог. Если установить OutputDirectory кому "/local/tmp/", выход становится "/local/tmp/promoters.diff".

Ссылки

[1] Трапнелл, Коул, Брайан А Уильямс, Гео Пертеа, Али Мортазави, Гордон Кван, Марике Дж. ван Барен, Стивен Л Зальцберг, Барбара Дж. Уолд и Лиор Пэхтер. «Сборка и количественная оценка транскриптов с помощью РНК-Seq выявляет необъявленные транскрипты и переключение изоформ во время дифференцировки клеток». Биотехнология природы 28, № 5 (май 2010 года): 511-15.

[2] Андерс, Саймон и Вольфганг Хубер. «Анализ дифференциальных выражений для данных подсчета последовательностей». Биология генома 11, № 10 (октябрь 2010): R106. https://doi.org/10.1186/gb-2010-11-10-r106.

[3] Мортазави, Али, Брайан А Уильямс, Кеннет Маккью, Лориан Шеффер и Барбара Уолд. «Картирование и количественное определение транскриптомов млекопитающих с помощью РНК-Seq». Методы природопользования 5, № 7 (июль 2008 года): 621-28. https://doi.org/10.1038/nmeth.1226.

См. также

|

Темы

Внешние веб-сайты

Представлен в R2019a

Документация по инструментарию биоинформатики

Поддержка