Создайте CufflinksOptions объект, чтобы задать опции запонки, такие как количество параллельных нитей и выхода директории для хранения результатов.

cflOpt = CufflinksOptions;
cflOpt.NumThreads = 8;
cflOpt.OutputDirectory = "./cufflinksOut";

Файлы, предоставленные для этого примера, содержат выровненные показания для Mycoplasma pneumoniae из двух выборок с тремя повторениями каждый. Считывания моделируются 100bp-считывания для двух генов (gyrA и gyrB) расположены рядом друг с другом на геноме. Все чтения сортируются по ссылочному положению, как требуется cufflinks.

sams = ["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam",...
        "Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"];

Соберите транскриптом из выровненных показаний.

[gtfs,isofpkm,genes,skipped] = cufflinks(sams,cflOpt);

gtfs представляет собой список файлов GTF, которые содержат собранные изоформы.

Сравнение собранных изоформ с помощью cuffcompare.

stats = cuffcompare(gtfs);

Объедините собранные транскрипты с помощью cuffmerge.

mergedGTF = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput');

mergedGTF сообщает только один транскрипт. Это потому, что два интересующих гена расположены рядом друг с другом, и cuffmerge не может различать два разных гена. Вести cuffmerge, используйте ссылку GTF (gyrAB.gtf) содержащая информацию об этих двух генах. Если файл расположен не в той же директории, который вы запускаете cuffmerge от, вы также должны задать путь к файлу.

gyrAB = which('gyrAB.gtf');
mergedGTF2 = cuffmerge(gtfs,'OutputDirectory','./cuffMergeOutput2',...
			'ReferenceGTF',gyrAB);

Вычислите изобилие (уровни выражения) из выровненных показаний для каждой выборки.

abundances1 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput1');
abundances2 = cuffquant(mergedGTF2,["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"],...
                        'OutputDirectory','./cuffquantOutput2');

Оцените значимость изменений экспрессии для генов и транскриптов между условиями, выполнив дифференциальную проверку с использованием cuffdiff. cuffdiff функция действует в двух разных шагах: функция сначала оценивает изобилие по выровненным чтениям, а затем выполняет статистический анализ. В некоторых случаях (для примера, распределение вычислительной нагрузки между несколькими работниками), выполнение двух шагов отдельно желательно. После выполнения первого шага с cuffquant, можно затем использовать двоичный выходной файл CXB в качестве входов для cuffdiff для выполнения статистического анализа. Поскольку cuffdiff возвращает несколько файлов, задает рекомендуемую выходную директорию.

isoformDiff = cuffdiff(mergedGTF2,[abundances1,abundances2],...
                      'OutputDirectory','./cuffdiffOutput');

Отобразите таблицу, содержащую результаты дифференциального экспрессионного теста для этих двух генов gyrB и gyrA.

readtable(isoformDiff,'FileType','text')

ans =

  2×14 table

        test_id            gene_id        gene              locus             sample_1    sample_2    status     value_1       value_2      log2_fold_change_    test_stat    p_value    q_value    significant
    ________________    _____________    ______    _______________________    ________    ________    ______    __________    __________    _________________    _________    _______    _______    ___________

    'TCONS_00000001'    'XLOC_000001'    'gyrB'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     1.0913e+05    4.2228e+05          1.9522           7.8886      5e-05      5e-05        'yes'   
    'TCONS_00000002'    'XLOC_000001'    'gyrA'    'NC_000912.1:2868-7340'      'q1'        'q2'       'OK'     3.5158e+05    1.1546e+05         -1.6064          -7.3811      5e-05      5e-05        'yes'   

Вы можете использовать cuffnorm чтобы сгенерировать нормированные таблицы выражений для последующих анализов. cuffnorm результаты полезны, когда у вас есть много выборки, и вы хотите объединить их или построить уровни экспрессии для генов, которые важны в вашем исследовании. Обратите внимание, что вы не можете выполнить дифференциальный анализ выражения, используя cuffnorm.

Задайте массив ячеек, где каждый элемент является строковым вектором, содержащим имена файлов для одной выборки с репликами.

alignmentFiles = {["Myco_1_1.sam","Myco_1_2.sam","Myco_1_3.sam"],...
                  ["Myco_2_1.sam", "Myco_2_2.sam", "Myco_2_3.sam"]}
isoformNorm = cuffnorm(mergedGTF2, alignmentFiles,...
                      'OutputDirectory', './cuffnormOutput');

Отобразите таблицу, содержащую нормированные уровни выражения для каждого транскрипта.

readtable(isoformNorm,'FileType','text')

ans =

  2×7 table

      tracking_id          q1_0          q1_2          q1_1          q2_1          q2_0          q2_2   
    ________________    __________    __________    __________    __________    __________    __________

    'TCONS_00000001'    1.0913e+05         78628    1.2132e+05    4.3639e+05    4.2228e+05    4.2814e+05
    'TCONS_00000002'    3.5158e+05    3.7458e+05    3.4238e+05    1.0483e+05    1.1546e+05    1.1105e+05

Имена столбцов, начинающиеся с q, имеют формат conditionX_N, указывающий, что столбец содержит значения для репликации N conditionX.